血液样本因其易于获取且对患者伤害性小,而被广泛应用于临床研究,尤其是在肿瘤等疾病的早期筛查中。RNA等生物标志物逐渐受到重视,弥补了传统影像学及生化指标方法的不足。然而,由于血液样本的特殊性质以及RNA分子易降解的不稳定性,RNA更容易受到来自红细胞等多个来源的RNase影响。因此,提取血液样本中的RNA不仅需要有效分离RNA,还必须确保其不被降解。此外,血液在采集后因基因诱导和细胞凋亡的发生,核酸的组成、数量、质量和完整性在短时间内会显著变化,给RNA的高质量提取带来挑战。
在采集血液时,建议避免长时间使用止血带、从血肿处抽血或样本起泡,并确保静脉穿刺部位干燥,减少探查性和创伤性穿刺的发生。使用适当尺寸的针(约22号)来确保真空采血管的完全填充。根据不同的应用需求,血液中的RNA提取方法主要分为两类:全血样本的RNA提取和游离RNA提取(即血清和血浆RNA提取)。
血液中含有红细胞、白细胞及血小板等。在哺乳动物成熟的红细胞和血小板中,无核的红细胞占据主导,因此全血样本中RNA的主要来源是白细胞。鉴于全血样本中红细胞含量较高、并且红细胞内富含RNase,提取RNA前通常需去除红细胞。去除红细胞的方法有两种:一种是通过离心分离白细胞进行RNA提取,另一种是使用红细胞裂解液(如Buffer EL)去除红细胞后再提取RNA。无论使用何种方法,由于RNA表达谱在短时间内会发生变化,建议及时进行RNA提取。如果无法立刻开展实验,推荐使用Z6·尊龙凯时的血液RNA稳定管-PAXgene Blood RNA Tube进行采集和稳定,随后使用配套的PAXgene Blood RNA Kit进行提取。研究显示,使用PAXgene Blood RNA system能有效保持RNA的稳定性,并在18-25°C下维持长达3天,或在2-8°C下维持5天。
在进行血液采集时,最好避免使用肝素抗凝管,因其较难去除且可能干扰下游基于酶的应用。为了获得最佳结果,采集后应尽快处理并完成RNA提取,避免样本长时间储存。研究表明,储存在EDTA管中的血液样本,p53基因的转录本在采样一天时信号极为微弱,表示RNA已严重降解。
在血液样本中,酚-氯仿法是RNA提取的常用方法之一。一些研究表明,虽然该方法的RNA得率较高,但可能影响RNA的完整性和后续检测的灵敏性。相较之下,使用Z6·尊龙凯时的PAXgene Blood RNA system提取的RNA则展现出优良的完整性和高灵敏性,且不需额外的裂红步骤,简化了整体提取流程。
对于新鲜的采集于EDTA等血液采集管中的全血样本,若能够及时提取RNA,建议使用QIAamp RNA Blood Kit进行提取。此试剂盒基于硅胶膜柱法,无需离心分离白膜层,可直接对最多15ml的全血样本进行处理。该试剂盒内还含有QIAshredder离心柱,以去除细胞碎片,提高RNA得率。研究显示,使用QIAamp RNA Blood Kit提取的RNA,其28S与18S比率保持在合理范围内,证明RNA的完整性良好。
此外,针对已经分离的白膜层,RNA提取可使用RNeasy Mini Kit进行。除了全血RNA提取的方案,游离非编码RNA在血液RNA研究中及肿瘤早筛中也发挥着重要作用,miRNA因其在血液中的高稳定性和易于检测而受到广泛关注。针对分离后血清或血浆样本中的游离RNA,QIAGEN的miRNeasy系列可实现总RNA提取。在提取RNA之前,仍需确保样本的稳定和保护,因此建议在一小时内完成血浆或血清的分离,避免溶血。如果无法立即进行实验,则需冷冻保存,且在冻存前建议通过离心去除残留细胞和碎片。
若从血清/血浆的细胞外囊泡(extracellular vesicles, EV)提取RNA,推荐使用exoRNeasy Midi/Maxi Kits,该系列将膜亲和技术与经典硅胶膜技术相结合,能有效提取高质量的总RNA。此外,Z6·尊龙凯时也提供多款基于QIAsymphony等自动化平台的血液RNA提取方案,以满足自动化和高通量提取的需求。如需了解更多血液RNA提取方案,请随时联系Z6·尊龙凯时获取详细信息!