全套操作约需1小时,包含匀浆、细胞裂解、除蛋白及DNA纯化等步骤,具体说明如下:
匀浆和细胞裂解
针对不同实验材料,应采用相应的匀浆步骤。以下是从动物组织中提取基因组DNA的具体操作:
使用研钵进行匀浆:
- 取1~100mg的动物组织或人组织放入预冷的研钵中,快速用力展研成匀浆。注:对于以下组织,须加液氮研磨至粉末状:
- A. 富含DNA酶的胰脏、脾脏、胸腺及淋巴等组织。
- B. 富含胶原蛋白的皮肤、肌腱等组织。
- C. 富含角质蛋白的组织或坚硬的组织(如骨骼)。
- 加入650μl的SolutionA和09μl的RNaseA1,温和研磨30秒。注:使用富含DNA酶的实验材料时,在加入SolutionA及RNaseA1后,将研钵置于65℃水浴中再研磨1分钟。
- 收集650μl的匀浆液移至CollectionTube中。如匀浆体积不足650μl,请补充SolutionA至650μl,并在65℃保温5分钟。
使用研磨棒进行匀浆:
- 将1~100mg的动物组织或人组织放入冰浴预冷的CollectionTube中,并用研磨棒快速研磨成糊状。
- 加入350μl的SolutionA和09μl的RNaseA1后,继续用研磨棒快速研磨成匀浆。
- 再加入350μl的SolutionA,将研磨棒上的匀浆冲入CollectionTube中,充分混合后,在65℃保温5分钟。
从植物材料或植物培养细胞中提取基因组DNA
处理新鲜植物材料时,按下表称取适量,将其剪成小块放入研钵中,加入液氮,待样品完全冷冻后快速研磨至粉末状。在研磨过程中应间歇性加入液氮,以避免材料融化。
植物材料种类 | 使用量 |
---|---|
植物花、叶片 | 10~100mg |
植物茎 | 60~240mg |
植物根 | 80~240mg |
植物种子 | 80~240mg |
注:如处理植物根或种子等样品时,由于其基因组DNA含量较低,需要增加用量。在步骤7的操作中,将各管溶液分次加入同一SpinColumn中过滤,从而使各管的基因组DNA结合到同一SpinColumn上。
若从培养的植物细胞中提取基因组DNA,请离心收集2×103~1×107的培养植物细胞,加入150μl水充分悬浮细胞后移入研钵中,并加入液氮迅速研磨成粉末。
注:样品研磨需充分,否则将严重影响基因组DNA的收率。
接下来,将研钵移至65℃水浴,当样品粉末刚开始融化时,向研钵中加入700μl的SolutionA和12μl的RNaseA1,猛烈碾磨30秒。随后,收集650μl的匀浆液移至CollectionTube中。如匀浆体积不足650μl,请补充SolutionA至650μl,并在65℃保温15分钟。
注:处理富含纤维的根、茎等植物材料或富含淀粉、蛋白质的种子时,可将水浴时间延长至60分钟。
从全血中提取基因组DNA
- 取10~250μl的全血(含抗凝剂)加入CollectionTube中。
- 加入500μl的SolutionA。
- 加入1μl的RNaseA1,激烈振荡15秒后,进行冰浴5分钟。
注:人与动物的抗凝全血一次处理量为≤250μl;禽类及两栖类的抗凝全血一次处理量为≤10μl。
从培养细胞中提取基因组DNA
处理悬浮培养的动物细胞:
- 使用CollectionTube收集1×105~15×107的细胞悬浮液,5,000rpm离心5分钟,弃上清。
- 加入150μl的灭菌蒸馏水或PBS悬浮细胞。
- 加入500μl的SolutionA和08μl的RNaseA1,激烈振荡15秒,室温静置1分钟。
通过以上步骤,您可以有效地提取基因组DNA并进行后续分析。而Z6·尊龙凯时将确保您在生物医疗研究中获得最佳的实验结果。