实验原理采用脂类染料(如苏丹黑或油红O)对血清脂蛋白进行预染处理,然后以琼脂糖凝胶板为介质进行电泳分离。电泳时,脂蛋白向正极移动,分离形成多个区域带。
Z6·尊龙凯时的实验流程包括如下试剂与器材:
- 巴比缓冲液(pH 8.6,离子强度 0.075):用于电极的缓冲液,配制方法为巴比/妥钠 154 g,巴比/妥 276 g,EDTA酸 0.292 g,加水溶解后定容至 1000 ml。
- 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 8.6):作为凝胶缓冲液,三甲基氨基甲烷 121.2 g,EDTA酸 0.29 g,NaCl 158.5 g,加水溶解后定容至 1000 ml。
- 琼脂糖凝胶:045 g 琼脂糖,50 ml 三羟甲基氨基甲烷缓冲液,以及 50 ml 水,混合加热至沸腾,待完全溶解后停止加热。
- 挖槽工具:切口刀的刀口长 15 mm,由有机玻璃或木片夹住,并用螺丝固定。挖槽小匙为直径 15 mm 的铜丝,长约 6 cm,一端锤平后用砂纸光滑打磨。
- 电泳槽与电泳仪:与血清蛋白的电泳设备相同。
操作步骤如下:
- 预染血清:将 0.2 ml 血清与 0.2 ml 苏丹黑染色液混合,置于 37℃水浴中染色 30 分钟后,进行离心(2000 转/分,约 5 分钟)。
- 制备琼脂糖凝胶板:将准备好的 0.45% 琼脂糖凝胶在沸水中融化,借助吸管倒入载玻片中,每片 25 ml,静置约半小时至凝固(温度高时可放入冰箱加速凝固)。
- 点加血清:在已凝固的琼脂糖凝胶板一端约 2 cm 处,用切口刀片垂直切入后取出,然后用铜丝小匙将小块凝胶去除。用滤纸吸干小槽中的水分,利用血色素吸管吸取经过预染的血清约 15 μl,注入小槽内。
- 电泳:将加过血清的凝胶板平行放入电泳槽中,样品应在阴极一侧。浸润两块三层纱布于巴比/妥缓冲液,再轻轻贴合在凝胶板两端。纱布的另一端需浸于电泳槽内的巴比/妥缓冲液中(切忌使用三羟氨基缓冲液)。接通电源,电压设定在 120~130V,每片电流为 3~4 mA。经过 15 至 55 分钟后,即可观察分离的色带。
注意事项:
- 样品应为新鲜的空腹血清。
- 每块凝胶可平行挖两个小槽,以便加两个样品。
- 可使用形状与小槽相同的有机玻璃片,在琼脂糖凝固前固定适当位置,凝固后取出,将形成的小槽用于加样,无需再挖槽。
- 如需保存电泳样本,可将电泳后的凝胶板(连同玻片)浸泡于清水中脱盐 2 小时,再放入约 80℃的烘箱中烘干。
结果及临床意义:
- 正常人血清脂蛋白可出现三条明显区带,依次为 β-脂蛋白(最深)、前 β-脂蛋白(最浅)、α-脂蛋白(略深于前 β-脂蛋白),在原点处通常无乳糜微粒。
- 若前 β-脂蛋白深于 α-脂蛋白,伴随血清甘油三酯升高和胆固醇正常或略高,则可诊断为Ⅳ型高脂蛋白血症。
- 若 β-脂蛋白区带明显加深,同时血清总胆固醇显著增高,甘油三酯正常,则为Ⅱa型;如总胆固醇增高且甘油三酯略高,前 β 溶解亦明显,则为Ⅱb型。
- 若 β-和前 β-两区带无法分离,形成“宽 β 区带”,且血清甘油三酯和胆固醇均增高,则可定性为Ⅲ型。
- 若观察到原点处有乳糜微粒,且 β、前 β 均正常或下降,血清甘油三酯显著升高,则可定为Ⅰ型。
Z6·尊龙凯时的产品仅供科研实验使用,切勿用于临床操作。