### 抗体检测通用ELISA操作流程（效价测定）

#### 1. 包被步骤：

1) 使用包被缓冲液配制1-10μg/ml抗原溶液（现配现用）。

2) 向高结合力ELISA板（货号80112）每孔加入100μl抗原溶液，覆以封板膜，室温轻摇孵育2-6小时或在4℃下过夜。

3) 吸弃溶液，用洗涤缓冲液洗板2次。

#### 2. 封闭步骤：

1) 使用封闭缓冲液母液配制工作液，每孔加入300μl，室温轻摇孵育2-6小时或在4℃下过夜。

2) 吸弃封闭液并在吸水纸上拍干，板子可立即使用或密封保存于4℃备用。

#### 3. 抗体效价检测：

1) 用抗体稀释液对免疫前/后血清进行梯度稀释（1:100至1:100,000），每孔加入100μl。覆以封板膜，室温轻摇孵育30分钟。

2) 吸弃液体，用洗涤缓冲液洗板5次（每次200-300μl，洗涤不充分会导致高背景）。

3) 用抗体稀释液配制HRP标记抗兔二抗（1:5,000-1:20,000），每孔加入100μl（稀释不当可能导致显色过弱或背景过高）。

4) 覆以封板膜，室温轻摇孵育30分钟。

5) 吸弃液体，洗板5次后拍干。

6) 每孔加入100μl现成TMB底物溶液。

7) 覆以封板膜，室温轻摇孵育至阳性孔出现蓝色（最长15分钟）。

8) 每孔加入100μl终止液，蓝色将转变为黄色。

9) 在450nm波长下读取吸光度。

**注意事项：**

1) 本ELISA流程适用于针对纯化抗原（蛋白质或多肽）产生的抗体的定性检测，不适用于血清或其他体液中抗体浓度的定量测定。

2) 本流程默认一抗来自兔源，若使用其他宿主动物需选用相应二抗。

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